В ноябре 1637 г. игумен Вильнюсского монастыря Леонтий (Шитик-Залесский) ездил в Москву и получил от царя Михаила Фёдоровича 200 руб. в качестве пожертвования на обитель. В 1655 г., после взятия Вильно русскими войсками, были обретены и перенесены в Вильнюсский монастырь мощи Виленских мучеников Антония, Иоанна и Евстафия, святыню поместили в пещерном склепе Свято-Духовской церкви. В 1661 г. город вновь перешёл к Речи Посполитой. В 1676 г. сейм запретил всем ставропигиальным монастырям на территории Польского государства обращаться по вопросам веры к Константинопольскому патриарху и в спорных случаях предписал обращаться к гражданским судам. С 1686 г., когда Киевская православная митрополия перешла под омофор Московского патриарха, насельники Вильнюсского монастыря получили возможность обращаться за помощью непосредственно в Москву (отдельные монахи Вильнюсского монастыря с 1628 г. приезжали в Москву за милостыней). Грамотами Петра I 1703 и 1708 гг. братии разрешалось «приезжати в Московское государство для милости... сколько захотят». Монастырю давали крупные пожалования Пётр I, цесаревна Наталия Алексеевна. Однако виленские власти притесняли монастырь и препятствовали его контактам с Россией. В 1721 г. братия Вильнюсского монастыря писала в Святейший Синод Русской православной церкви, что «униатский оффициал, остригши игумену Иоасафу Опоцкому волосы и связавши его, уволок в свою Сутенскую обитель, иноков разогнал, а тамошних прихожан принуждает у себя исповедоваться и причащаться». Братия просила Синод принять монастырь «в свою пастырскую и отеческую протекцию» и назначить выплаты (50 руб. в год). Указом Синода от 2 апреля 1722 г. Вильнюсский монастырь был признан ставропигиальным. В 1733 г. императрица Анна Иоанновна назначила материальную помощь виленским монахам в размере 100 руб. ежегодно (выплачивалась до 1781 г.). Указом Синода 1741 г. наместники Вильнюсского монастыря назначались Киевскими митрополитами и утверждались Синодом. Во время пожаров 1748 и 1749 гг. сгорел Свято-Духовский храм, другие монастырские постройки, архив обители. В 1751 г. виленские власти выдали братии разрешение на восстановление монастыря. Виленский католический епископ Михаил Зинкевич в письме канцлеру Великого княжества Литовского поставил условия восстановления православных храмов: колокольня не должна выделяться среди городских строений, монастырские ворота не должны иметь излишних украшений. Автором проекта восстановления монастыря был архитектор Иоганн Криштоф Глаубиц, строительство шло медленно из-за нехватки средств. В 1795 г., после третьего раздела Польши, город Вильно вошёл в состав Российской империи, Виленская губерния стала частью Минской епархии, Вильнюсский монастырь перешёл в подчинение Минскому архиерею, который приписные к монастырю церковные учреждения сделал самостоятельными. В мае 1797 г. Вильнюсский монастырь был возведён во второй класс с сохранением за ним приписных Сурдегского, Кронского и Евейского монастырей; по штату, в обители жили иеромонах и два диакона. Из казны на содержание монастыря ежегодно выделялись 2,5 тыс. руб.