При почти полном исчезновении православного населения в Вильне, деятельность монастыря имела особое значение. Последнее жестокое надругательство над монастырём поляки-католики совершили в 1794 г., ограбив его, учинив насилие над настоятелем – 80-десятилетним старцем Георгием, одним из монахов, оставшихся в обители. Возрождение обители началось с 11 августа 1794 г., когда Вильна стал губернским городом Российской империи. Свято-Духов монастырь был определён как штатный второклассный с соответствующим жалованием. В 1796 г. братство при монастыре было распущено, а в 1797 г. монастырь был передан в ведение архиепископа Минского Иова. В 1833 г. по ходатайству настоятеля Платона (Рудинского) и по просьбе виленского генерал-губернатора князя Долгорукова обитель была переведена в первый класс, что влекло за собой улучшение её материального состояния. Святейший Синод выделил необходимые средства, и в 1836–1837 гг. по благословению архиепископа Полоцкого Смарагда Свято-Духовская церковь была перестроена по образцу православного храма (т.к. раньше походила на костёл). Архимандрит Платон (Городецкий) провёл в монастыре большие восстановительные работы. В 1844 г. церковь в честь Благовещения Пресвятой Богородицы была превращена в монастырскую трапезную, были сооружены святые врата. 4 июня 1845 г. архиепископ Виленский Иосиф (Семашко) освятил главный престол в перестроенной церкви Святого Духа (он был большим почитателем обители и Виленских мучеников). В 1850 г. архиепископ Виленский Иосиф на свои средства устроил покатый сход в пещеру, где почивали мощи мучеников, он же оплатил устройство пещерной церкви (иконы для алтаря были написаны академиком Хруцким). 14 апреля 1851 г. последовало освящение пещерного храма во имя мучеников Виленских. Стараниями владыки Иосифа и на пожертвования прихожан сооружена бронзовая, чеканная, позлащённая рака, в которую 14 апреля 1852 г. были помещены мощи мучеников. При устройстве церкви архиепископ Иосиф приготовил для себя в пещере каменный гроб и прикрыл его чугунной доской с надписью: «Помяни, Господи, раба Твоего святителя Иосифа. Святи мученицы Антоние, Иоанне и Евстафие, молите Господа о мне, грешном, 1850». Там он и был похоронен в 1868 г. 6 августа 1865 г. (после утверждения устава митрополитом Иосифом) после литургии было вновь торжественно открыто Виленское Свято-Духово братство. Теперь его целями стали благотворительность и содействие народному образованию. В 1915 г., при наступлении немцев, мощи Виленских мучеников были вывезены из монастыря в Москву. С 1922 по 1939 гг. монастырь находился на территории Польши и (вместе со всей Виленской епархией) был в составе Польской православной церкви. В пределах послевоенного СССР обитель не только осталась открытой, но и благоустроилась. 13 июля 1946 г. состоялось торжественное возвращение мощей святых Виленских мучеников в монастырь, где с тех пор торжественно отмечается этот день. В 1959–1960 гг. в церкви Святого Духа было оборудовано паровое отопление, в 1976 г. весь монастырский комплекс был подключён к городской системе теплоцентрали. В 1982 г. восстановили и освятили придел во имя апостола Иоанна Богослова в главном храме, тогда же был оборудован лифт на колокольне, а также благоустроен братский корпус. После распада СССР, при митрополите Виленском Хризостоме, соборный храм Святого Духа был основательно обновлён. В 1996–1997 гг. произвели капитальный ремонт перекрытий пола главного храма, деревянные балки заменили металлическими, а пол выложили керамическими плитками. Одновременно расширили пещерную церковь и сделали к ней два входа. Внутри и снаружи церковного здания провели косметический ремонт. В июле 1997 г. широко отмечался 400-летний юбилей монастыря и 650-летие со времени убиения Виленских мучеников. В то время на молитвенную память о посещении Свято-Духова монастыря патриарх Московский и всея Руси Алексий II (1990–2008 гг.) передал в дар обители евхаристические сосуды. В 1993 г. в Свято-Духовом монастыре была открыта общедоступная библиотека духовной литературы, насчитывавшая ко второй половине 2000 гг. около 13 тысяч томов (в обители кроме книг есть много церковных предметов). По воскресеньям в монастыре проводились встречи священнослужителей с мирянами, беседы по вопросам веры, просмотры аудио и видеоматериалов. В течение последних лет монастырь ежедневно предоставлял бесплатные обеды примерно тридцати нуждающимся, была устроена небольшая гостиница для паломников. На территории монастыря в заново отстроенном здании разместилось управление Виленской епархии: «Архиепископия» – канцелярия епархии; «Православное хозяйство», в ведении которого находятся имущественные дела; резиденция правящего архиерея, священноархимандрита Свято-Духова монастыря.