Первый заказ во Флоренции поступает от Аньоло Дони на портреты его и жены (последний написан Рафаэлем под явным впечатлением от «Джоконды»). Именно для Аньоло Дони Микеланджело Буонарроти в это время создаёт тондо «Мадонна Дони». Рафаэль пишет алтарные полотна «Мадонна на троне с Иоанном Крестителем и Николаем из Бари» (около 1505 г.), «Положение во гроб» (1507 г.) и портреты – «Дама с единорогом» (около 1506 – 1507 гг.). В 1507 г. он знакомится с Донато Браманте (1444–1514 гг.). Популярность Рафаэля постоянно растёт, он получает много заказов на образы святых – «Святое семейство со св. Елизаветой и Иоанном Крестителем» (около 1506 – 1507 гг.). «Святое Семейство (Мадонна с безбородым Иосифом)» (1505–1507 гг.), «Св. Екатерина Александрийская» (около 1507 – 1508 гг.). Во Флоренции Рафаэль создал около 20 Мадонн, хотя сюжеты стандартны: Мадонна либо держит Младенца на руках, либо Он играет рядом с Иоанном Крестителем, все Мадонны индивидуальны и отличаются особой материнской прелестью (по-видимому, ранняя смерть матери оставила глубокий след в его душе). Растущая слава Рафаэля приводит к росту заказов на Мадонн, он создаёт «Мадонну Грандунка» (1505 г.), «Мадонну с гвоздиками» (около 1506 г.), «Мадонну под балдахином» (1506–1508 гг.). К лучшим произведениям этого периода относятся «Мадонна Террануова» (1504–1505 гг.), «Мадонна с щеглёнком» (1506 г.), «Мадонна с Младенцем и Иоанном Крестителем („Прекрасная пленница“)» (1507–1508 гг.). Эти картины позволяют проследить быструю эволюцию Рафаэля, формирование из провинциального мастера в одного из ведущих художников Высокого Возрождения. Если в «Мадонне Грандунке» (Флоренция, галерея Питти) он ещё скован в передаче движения и пространстве и стремится, главным образом, к достижению пластического эффекта, то в таких картинах, как «Мадонна с щеглёнком» (Флоренция, Уффици), «Прекрасная садовница» (Париж, Лувр) или «Мадонна среди зелени» (Вена, Художественно-исторический музей), он добивается единства пространства и фигур, свободы движения и расположения групп. В этих картинах Рафаэль создаёт новый образ Мадонны – земной и реальный, но вместе с тем опоэтизированный, лишённый черт повседневной обыденности. Последняя его большая картина, написанная во время пребывания во Флоренции, – «Мадонна под балдахином» (Флоренция, галерея Питти) – своей композицией предваряет уже величественные алтарные картины римского периода. В 1507 г. Рафаэль снова ненадолго возвратился в родной город, а во второй половине 1508 г. по приглашению папы Юлия II (1503–1513 гг.) переезжает в Рим (там он проведёт всю оставшуюся жизнь) и становится при содействии Браманте официальным художником папского двора. Рафаэль появляется в Риме в то время, когда впервые в истории Возрождения «Вечный город» начал приобретать значение политического и культурного центра Италии. Ещё в конце XV в. Папская область во главе с Римом стала играть видную роль среди крупнейших итальянских государств. Менее развитая в экономическом отношении, чем Флоренция, но сильная своим международным значением, она на недолгое время стала как бы фокусом национально-объединительных стремлений в стране. Естественно, что, стремясь к объединению Италии под властью Рима, папы пытались превратить его в подлинную столицу, в политический и культурный центр.