Несмотря на то что сведения об удалении Исидора Пелусиота в пустыню довольно противоречивы, Эвьё склонен предполагать, что Исидор Пелусиот действительно начал свой монашеский путь в Нитрии, где находили приют многие интеллектуалы, искавшие аскетических подвигов. Все они в той или иной мере были продолжателями Оригена, всем им (в том числе и Исидору Пелусиоту) было свойственно стремление к поиску сокровенного смысла Священного Писания и к достижению созерцания. В письмах Исидора Пелусиота исследователи не нашли осуждения Оригена, хотя он жил во времена первых оригенистских споров. Высказываясь о доктрине «падения душ», Исидор Пелусиот констатирует лишь то, что это «спорный вопрос», и ревностно защищает Иоанна Златоуста от нападок «антиоригениста» архиепископа Феофила. Среди адресатов Исидора Пелусиота – оригенисты диакон Евагрий и монах Кассиан; также в письмах содержатся намёки на пребывание Исидора Пелусиота у египетских монахов Марка и Симона. В египетских монастырях (Нитрии и Келлиях) Исидор Пелусиот мог глубоко изучить Священное Писание под руководством духовных учителей. Во всяком случае, он не был знаком ни с общежительным монашеством Пахомия Великого, ни с буквалистической экзегезой монахов Скита. После некоторого пребывания в пустыне Исидор Пелусиот вернулся в Пелусий. Епископ города (предположительно Аммоний) рукоположил его во пресвитера и поручил должность церковного учителя (дидаскала). Утверждение отдельных Житий, что Исидор Пелусиот был рукоположён Афанасием I Великим, исследователи считают весьма сомнительным, т.к. этот факт с трудом может быть вписан в хронологические рамки жизни Исидора Пелусиота. После рукоположения Исидор Пелусиот оставил преподавание риторики и сосредоточился на изъяснении Священного Писания. После смерти епископа Аммония (около 413 г.) епископом Пелусия стал Евсевий. По не известным исследователям причинам между Исидором Пелусиотом и новым епископом возник конфликт. В трёх письмах Исидор Пелусиот напоминает своим адресатам о том, что он прежде других оказался жертвой епископа Евсевия. Исидор Пелусиот решил, по его собственному выражению, «бежать» в пустыню. На этот раз место его пребывания не было намного удалено от Пелусия. По мнению Эвьё, тот факт, что Исидор Пелусиот, неоднократно обращаясь с письмами к епископам восточной части Августамники, ни разу не пишет епископу города Афней (20 км к востоку от Пелусия), говорит о том, что он подвизался именно там или в каком-либо монастыре в окрестностях этого города. Его повседневная жизнь представляла собой жизнь обычного монаха, для которой были характерны постоянная молитва, пост, скромность в одежде, рукоделие, состоявшее в переписывании книг.