В последующих изданиях не публиковалось предисловие-посвящение митрополиту Иоасафу (Кроковскому), в остальном состав книги оставался неизменным, незначительные коррективы вносились в названия глав. «Алфавит духовный», составленный в подражание «Лествице» Иоанна Лествичника, представляет собой подборку нравственных поучений. Произведение написано в стилистике литературы барокко. Тема самопознания, в ходе которого человек понимает собственную «двухприродность» (наличие в себе телесной (внешней) и духовной (внутренней) сущностей), является одной из центральных в произведении. По мнению Исаии, основную роль в постижении добра и зла играют разум и умеренность, причина греха заключается в «бессловесном себя непознании». Исаия пишет о том, что перед каждым человеком стоит проблема выбора жизненного пути: или жить под воздействием изменчивых чувственных потребностей, или служить неизменному духовному началу. Автор считает, что только второй путь может привести к познанию Бога и единению с Ним. Исаия рассматривает ряд последовательных этапов «умного делания», через которое достигается единение человека с Богом: нравственное самосовершенствование, труд, который становится потребностью и радостью, отречение от мира телесных вещей, очищение и просветление ума, самоуглубление и, наконец, познание Бога. Исаия пишет о необходимости деятельного подвига, считая его основой христианской жизни: «Тебе дана сия временная жизнь, чтоб ты всяк день поучаешися, преуспеваеши и исправляеши добродетелей подвигом». Призывая православных к стойкости и смирению в условиях притеснений со стороны католиков, Исаия восхваляет бедность, осуждает богатство, проповедует идею равенства людей перед Богом. В разработке этих идей Исаия был близок к Иоанну (Вишенскому) и Иову (Княгиницкому), которые для достижения праведности считали необходимыми аскетические подвиги, восхваляли бедность и видели основной источник греха в стремлении к богатству. По мысли Исаии, природа, живая и неживая, была создана Богом для нужд человека (эта мысль перекликается с идеями, высказанными в «Поучении» Владимиром Мономахом и в «Шестодневе» Иоанном, экзархом Болгарским). В «Алфавите духовном» Исаия упоминает собственное сочинение «Книжица, нареченная Седмодневник» (не сохранилась), посвящённое познанию человеком мира, самого себя и Бога.