В Ладинском и Мгарском монастырях Исаия выкопал пещеры (землянки) под кельи. Через непродолжительное время Исаия, назначив наместниками Густынского и Мгарского монастырей иеросхимонахов Василия и Филарета, вернулся в Межигорский монастырь. Исследователи полагают, что позднее Исаия состоял в братии Киево-Печерского монастыря, т.к. в грамоте Иерусалимского патриарха Феофана IV от августа 1620 г. Исаия упомянут как «инок святобливый монастыря Печерскаго». О принадлежности Исаии к киево-печерской братии говорится и в «Летописцах Волыни и Украины». 6 октября 1620 г. в Богоявленской церкви Братского монастыря Иерусалимским патриархом Феофаном, Софийским митрополитом Неофитом и Стагонским епископом Авраамием Исаия был тайно хиротонисан во епископа Перемышльского и Самборского. Это была первая епископская хиротония, совершённая Иерусалимским патриархом для восстановления иерархии Западнорусской митрополии. Польские власти не признали поставление. В начале января 1621 г. Исаия провожал патриарха Феофана, который возвращался на Восток, до города Буша, оттуда поехал на Волынь, затем в Перемышль, где изгнал с кафедры униатского Перемышльского епископа Афанасия (Крупецкого); позднее польские власти признали кафедральный собор в Перемышле за православными. Затем Исаия направился в Старый Самбор – второй кафедральный город епархии, где при поддержке местной шляхты развернул борьбу против униатов, предотвратил их попытку перевести в унию Лавровский Онуфриевский монастырь. Тогда же он изгнал из епископской резиденции в Спасском Старосамборском монастыре (существовал на территории современного села Спас Львовской области, Украина) Афанасия (Крупецкого), вследствие чего в отношении Исаии было начато судебное преследование, и он был вынужден вернуться в Киев. Исаие не удалось остаться в Межигорском монастыре, поскольку его насельники избрали нового игумена. Прожив некоторое время в Киеве, епископ избрал из межигорских монахов 26 человек и отправился с ними в Густынскую обитель, куда прибыл 24 сентября 1621 г.; вскоре по совету с братией начал строить в монастыре «церковь великую». Оставив в Густынском монастыре игуменом иеромонаха Филарета, Исаия отправился в Лубны (современная Полтавская область, Украина), занялся обустройством Мгарского монастыря и 8 июня 1628 г. заложил там Преображенскую церковь. Для молитвенного уединения Исаия удалялся в Ладинский монастырь, жил в выкопанной им пещере. В 1622 г. основал братство при Троицком соборе в Лубнах. 4 декабря 1622 г., во время очередных гонений на православных в Речи Посполитой, Исаия направил посольство во главе с иеромонахом Мгарского монастыря Гедеоном (Слобиной) к царю Михаилу Фёдоровичу и к Московскому патриарху Филарету. В посланиях к царю и патриарху Исаия, жалуясь на преследования, просил о материальной помощи. К Филарету он обращался как к «патриарху Великой и Малой России и до последних Великого океяну», подписался как «Вашей святительской милости епископ и эксарх Малой России, земли Киевской». В послании содержатся слова: «Не имамы бо никакого прибежища и пристанища разве Господа Бога и благочестиваго и православнаго царя московскаго».