6 октября 1820 г. Луцкий епископ Иаков Мартусевич рукоположил Иосифа Семашко во иподиакона (в состоянии целибата), 26 декабря того же года – во диакона, а 28 декабря 1821 г. – во иерея. 7 января 1822 г. Иосиф Семашко получил сан протопресвитера (протоиерея) и стал благочинным униатских церквей Луцкого уезда. По инициативе епископа Иакова 20 июня 1822 г. Иосиф Семашко был переведён в Санкт-Петербург на должность заседателя второго униатского департамента Римско-католической коллегии Главного управления иностранных исповеданий. 23 марта 1823 г. получил звание каноника, а 8 октября 1825 г. – прелата. К началу XIX в. на западе и северо-западе Белоруссии, а также на Украине и в Литве проживало около 1,5 млн. униатов – в основном, крепостных крестьян, принадлежавших польским помещикам. Непоследовательность политики русского правительства, отсутствие православной миссии среди униатов, активная деятельность католического духовенства, польских помещиков и монахов василианского Ордена, действовавшего при молчаливой поддержке большей части епископата, вышедшего из этого Ордена, вели унию к полной латинизации и растворению в польском католицизме. Слиянию унии с римским обрядом и утрате остатков самобытности в литургической области противостояли униатские архиереи Киевский митрополит Ираклий Лисовский, Полоцкий архиепископ Иоанн Ястржембец-Красовский и члены Брестского капитула. Иосиф Семашко также пытался противодействовать польско-латинскому прозелитизму. Так, во время суда над униатским архиепископом Иоанном Красовским по сфабрикованному василианами обвинению Иосиф Семашко выступил в защиту этого иерарха, известного противника латинизации униатского богослужения и сторонника лояльности к русскому правительству. В 1826 г. в Римско-католической коллегии Иосиф Семашко инициировал дело о возвращении более 20 тыс. униатов, незаконно переведённых ксёндзами в латинский обряд в Вилейском и Дисненском уездах (к этому делу присоединили также случаи перехода в латинство униатов в других уездах Минской и Виленской губерний, имевшие место при содействии Виленской и Минской римско-католической консисторий). Во время службы в коллегии Иосиф Семашко неоднократно препятствовал принятию решений, ущемляющих интересы греко-католиков. Однако постепенно он разочаровался не только в римском католицизме, но и в унии, неспособной противостоять денационализации белорусов и украинцев. Этому содействовали духовный опыт, приобретённый во время посещений православных богослужений, новые знания, почерпнутые из русской духовной и художественной литературы, и яркие впечатления от посещения столицы империи, в частности, Андреевского собора. В 1827 г. Иосиф Семашко, несмотря на блестящие перспективы карьерного роста в греко-католической церкви, решил присоединиться к православию, принять монашеский постриг и поступить в Александро-Невскую лавру. Обосновывая своё стремление, он начал писать «Сочинение о Православии Восточной Церкви», в котором заявлял о ложности римо-католицизма.