В 1523 г. (по некоторым сведениям, в 1537 г.) Патмос был окончательно включён в состав Османской империи. Во время османского владычества остров не был заселён турками. На соседнем с Патмосом острове Липси приняли мученическую кончину пять Липсийских преподобномучеников: монахи Неофит с острова Аморгос (ум. 6 апреля 1558 г.), Иона с острова Лерос (ум. 28 февраля 1561 г.), Иона Гарбис с острова Нисирос (ум. в апреле 1635 г.), Парфений из Филиппополя (ныне Пловдив, Болгария; ум. в 1696 г.) пострадали от турок, монах Неофит (ум. 8 декабря 1609 г.) – от пиратов. Исследователям неизвестно, когда в поздневизантийский период монастырь Иоанна Богослова перешёл с общежительного на особножительный устав. В 1579 г. братия монастыря Иоанна Богослова, побуждаемая Константинопольским патриархом Иеремией II, решила восстановить в обители общежительный устав. Но через два года и один месяц пришлось отказаться от киновиального образа жизни. Большую роль в развитии просвещения на Патмосе сыграл деятельный и образованный игумен Никифор Хартофилакс с острова Крит (впоследствии митрополит Лаодикийский; ум. в 1628 г.), преподававший в монастыре Иоанна Богослова в конце XVI – начале XVII в. философию и древнегреческий язык и завещавший монастырю личную библиотеку. Конец XVI – XVII вв. характеризуется большой строительной активностью. Около 1598 г. был построен парекклисион Честного Креста, в 1601 г. были укреплены стены и возведён восточный контрфорс, в 1603 г. Никифор Хартофилакс воздвиг перед входом в монастырь парекклисион св. Апостолов (иконостас 1607 г.). В начале XVII в. (раньше 1605 г.) был сооружён парекклисион Иоанна Предтечи, строительство которого связано с именем кафигумена Парфения (Панкостаса; 1602–1606, 1610–1612 гг., ум. в 1629 г.), основавшего также монастырь иконы Божьей Матери «Живоносный Источник» (1607 г.) и парекклисион преподобного Онуфрия близ входа в монастырь Иоанна Богослова (1611 г.). В 1625 г. рядом с кафоликоном (соборным храмом) была построена библиотека для хранения книг, подаренных Никифором Хартофилаксом (в 1859 г. преобразована во «внешнюю ризницу»). После землетрясения 1646 г. были проведены работы по укреплению стен, в том числе на средства патмосца Николая Мафаса был возведён большой контрфорс, охватывающий северо-восточный угол монастыря. К этому же времени относится сооружение парекклисиона Василия Великого рядом со звонницей на плоской крыше у северной стены. Процветание монастыря Иоанна Богослова продолжалось до начала Турецко-венецианских войн (1645–1669 гг.) за обладание Критом. Из многочисленных подворий монастыря Иоанна Богослова на островах Эгейского и Ионического морей, на малоазийском побережье, в Валахии и Грузии особую роль играли подворья на Крите. Главное из них – монастырь апостола Иоанна Богослова, именуемый Стилос, близ Ханьи, откуда на Патмос поставлялись иконы критских живописцев.