В 1929 г. католическая церковь в Польше инициировала дело о ревиндикации (отчуждении) храмов и имущества православной церкви, принадлежавших до 1839 г. униатам. В Гродненской епархии католики требовали возвращения 174 церквей. Православным в судебном порядке удалось отстоять значительную их часть. Тем не менее, у Гродненской епархии было отнято около сотни храмов, в том числе кафедральный Софийский собор, храм в честь Рождества Пресвятой Богородицы в Мурованке. В 1938 г. в Гродно была разобрана церковь во имя князя Александра Невского. Имели место случаи насильственного захвата православных церквей католиками. Польское правительство совместно с католическим духовенством осуществляло политику полонизации православной церкви и возрождения униатства, в том числе в пределах Гродненской епархии. В 1924 г. недалеко от Слонима был организован неоуниатский миссионерский центр Альбертин, в деревне Сынковичи действовал его филиал. Власти добивались использования польского языка в православном богослужении, в проповедях, в преподавании Закона Божия. Несогласных священнослужителей лишали приходов, облагали денежными штрафами, арестовывали, депортировали в концентрационный лагерь в Берёзе-Картусской. Полонизации православной церкви содействовали «общества православных поляков», а также созданный в Гродно в 1938 г. при поддержке властей «Польский православный научно-издательский институт». В октябре 1939 г. территория епархии оказалась в составе БССР. Незадолго до введения советских войск в Западную Белоруссию Гродненский епископ Савва (Советов) эмигрировал. Гродненскую епархию возглавил архиепископ Пантелеимон (Рожновский), прежде находившийся на покое: он был уволен за непризнание автокефалии православной церкви в Польше. Патриарший Местоблюститель митрополит Сергий (Страгородский) утвердил его правящим архиереем Пинско-Новогрудской епархии, в состав которой были включены гродненские земли. 24 июня 1940 г. указом митрополита Сергия Гродненская епархия была восстановлена с названием Гродненская и Вилейская. Епархия объединила территорию бывшей Гродненской, Виленской и Пинско-Новогрудской епархий, кроме территорий, отошедших Литве, и включала 307 приходов. В октябре 1940 г. епархия вошла в Экзархат Западной Украины и Западной Белоруссии. 24 марта 1941 г. в епархии было учреждено Брестское викариатство во главе с епископом Венедиктом (Бобковским). Во время Великой Отечественной войны территория епархии с городами Гродно, Волковыск и Белосток была присоединена немецкими оккупационными властями к Восточной Пруссии. В 1941 г. архиепископ Пантелеимон назначил управляющим приходами на этой территории Брестского епископа Венедикта, жившего в Жировицком монастыре. По благословению епископа Венедикта в Гродно и Жировичах открылись курсы по подготовке кандидатов в священнослужители. 6 октября 1941 г. епископ Венедикт вместе с архиепископом Пантелеимоном принял условия Генерального комиссариата Белоруссии о подготовке к учреждению автокефальной церкви. 3 марта 1942 г. на Соборе белорусских епископов было решено учредить шесть епархий, среди них – Гродненскую и Белостокскую во главе с архиепископом Венедиктом (Бобковским), который вошёл в Синод Белорусской православной церкви. Архиепископ Венедикт не присутствовал на Всебелорусском соборе 30 августа 1942 г., где был утверждён статут Белорусской православной автокефальной церкви, и не прислал от епархии делегатов.