В конце XVI в. в Гродно и пригороде действовало девять православных церквей, Коложский мужской монастырь во имя князей Бориса и Глеба, а также три костёла, два католических монашеских ордена. В 1591 г. в Гродно было учреждено православное братство с типографией и школой для обучения детей «письму греческому и русскому, арифметике». С 1536 г. известен православный Пречистенский храм в Волковыске. В XVI в. были возведены православные церкви в честь Рождества Пресвятой Богородицы в Мурованке (современный Щучинский район) и во имя архангела Михаила в Сынковичах (современный Зельвенский район). В середине XVI в. в Западной Белоруссии широко распространились насаждаемые местными магнатами протестантские учения: кальвинизм, которому покровительствовал князь Николай Радзивилл Чёрный, и социнианство, насаждавшееся Янушем Кишкой. Распространение протестантских идей в западно-белорусских землях (как и во всей Речи Посполитой) было остановлено в ходе Контрреформации благодаря деятельности иезуитов, основывавших училища и монастыри. К концу XVI в. на гродненских землях было открыто восемь школ иезуитов (в Гродно, Слониме, Дрогичине и других городах). После принятия большинством западнорусских епископов во главе с Киевским митрополитом Брестской унии 1596 г. почти все православные храмы и монастыри в гродненских землях в течение нескольких десятилетий перешли к униатам, которые основали здесь 13 базилианских монастырей. Униатскими приходами и монастырями на Гродненщине управлял митрополит, живший в Вильно или Новогрудке. Ужесточение законов Речи Посполитой в отношении православных и агрессивная прозелитическая деятельность иезуитов способствовали тому, что большинство местной православной шляхты в конце XVI – первой трети XVII вв. перешло в католичество (Воловичи, Кунцевичи, Халецкие, Ходкевичи и др.). В 1622 г. по инициативе гродненского старосты С. Косодубского в городе была устроена миссия иезуитов, в 1625 г. преобразованная в резиденцию, в 1664 г. – в коллегию. Миссии иезуитов были также основаны в Волковыске и других городах (ликвидированы в связи с запретом деятельности Общества Иисуса в Речи Посполитой в 1773 г.). В 1643 г. магнаты-католики Веселовские основали в Гродно женский монастырь во имя св. Бригиты, на содержание которого ктиторы пожертвовали несколько участков в городе и имения в Гродненском и Волковысском поветах. До 1655 г. на Гродненщине появилось 22 новых католических костёла и монастыря. Политика латинизации и полонизации распространялась не только на православных, но и на униатов. Последний крупный переход униатов в католический обряд на гродненских и виленских землях произошёл вскоре после 1795 г., когда его приняли около 200 тыс. человек. К концу XVIII в. в Гродно не сохранилось ни одного православного прихода. Верными православию на гродненских землях оставались монастыри: заблудовский в честь Успения Пресвятой Богородицы, бельский во имя Николая Чудотворца, дрогичинские в честь Святой Троицы и Спасо-Преображенский, подчинявшиеся Киевскому митрополиту, который с 1783 г. управлял ими, как и всеми православными жителями Речи Посполитой, посредством своего наместника – Слуцкого архимандрита.