В середине XIII в. Волковыск упоминается как центр небольшого княжества во главе с князем Глебом. Волковысский князь занимал подчинённое положение по отношению к правителю Новогородка и Великого княжества Литовского. Около 1253/1254 г. в результате мира, заключённого между литовским правителем и Галицко-Волынскими князьями, сын великого князя Даниила Галицкого Роман (ум. около 1260 г.), женившись на дочери Глеба Волковысского, получил от литовской стороны в держание Новогородок, Волковыск, Слоним и ряд других городов. Позднее эти владения перешли к его брату князю Шварну Даниловичу (ум. около 1269 г.). В начале XIV в. Волковыск запустел. В конце столетия, во время подчинения города великому князю Витовту, жизнь в городе оживилась. Наряду с Городно и Новогородком Волковыск считался одним из административных центров понеманских волостей. В списке «А се имена всем градом рускым, далним и ближним», где названы Гродно, Лида и Новогородок, Волковыск не упоминается (Полное собрание русских летописей). Галицко-Волынские князья утратили контроль за Понеманьем в период правления Литовского великого князя Тройдена (около 1270 – 1282 гг.), который в 1276 г. поселил в подчинённых ему Городно и Слониме язычников-пруссов, бежавших от крестоносцев. В 1289 г. Литовские князья братья Бутигейд и Пукувер отдали Волковыск Владимирскому и Берестейскому князю Мстиславу Даниловичу (ум. после 1300 г.), «абы с ними мир держал» (Полное собрание русских летописей). В начале XIV в. Городно начал управлять ближайший соратник великого князя Литовского Гедимина – православный князь Давид (ум. в 1326 г.), сын Псковского князя Довмонта (Тимофея). В 1360 гг. в Городно правил князь Патрикий Кейстутович, а после его смерти – его младший брат Витовт (с 1374 г.), в руках которого в 1380 гг. сосредоточилась власть почти над всеми крупными городами Понеманья и Подляшья. С середины XIV в. Городно и Волковыск входили в состав Трокского судебно-административного округа Великого княжества Литовского. После трёхлетней борьбы Польского короля Владислава (Ягайло) в 1392 г. правителем Великого княжества Литовского был поставлен Витовт, получивший города Городно (который стал второй после Вильно столицей Великого княжества Литовского), Троки, Волковыск и др. В конце 1390 гг. в Городно Витовт построил вместо деревянного каменный готический замок (этого требовала необходимость обороны города: в конце XIII – начале XV вв. он больше десяти раз подвергался осадам, преимущественно войсками ордена меченосцев), в 1389 г. на Торговой площади была возведена фара Витовта – Пречистенский деревянный костёл (с 1587 г. – каменный, в 1807 г. освящён как православный Софийский собор, в 1961 г. взорван). В 1406 г., после похода на Псков, Витовт поселил в районе Борисоглебской церкви часть пленных жителей псковского пригорода Коложа, название которого перешло на гродненский посад. Религиозная политика, проводившаяся Витовтом в согласовании с его верховным сюзереном – Польским королём, была направлена на поддержку деятельности католической церкви на землях Великого княжества Литовского, в частности, в родовых владениях Витовта. До 1409 г. Витовт выступил в качестве главного фундатора и ктитора костёла во имя Николая Чудотворца в Волковыске, на содержание которого великий князь пожаловал село Ясиновичи, имения Волконовичи, Лебетовчину и Исаевичи.