В 1633 г. мещанин И. Сергиевич завещал Гродненскому монастырю несколько участков пашенной и сенокосной земли. После принятия большинством западнорусских архиереев во главе с Киевским митрополитом Брестской унии 1596 г. Гродненский монастырь стал объектом споров между православными и униатами. В 1612 г. польский король Сигизмунд III сан архимандрита передал сыну Климента (Годкинского) Михаилу, монаху виленского Троицкого монастыря (пребывавшего в унии с 1609 г.). С 1630 г. управление гродненской униатской архимандрией принял на себя архиепископ Смоленский Лев Кревза. При нём монастырь вёл тяжбу за возвращение фольварка Понемонь. Митрополит Пётр (Могила) выступал с инициативой учреждения в Гродненском монастыре «резиденции или самого православного Киевского митрополита или его коадъютора для управления неуниатскими церквами и духовенством». Универсалом короля Владислава IV Вазы от 14 марта 1633 г. Гродненский монастырь получил статус резиденции Западнорусской митрополии, однако передача монастыря Киевскому митрополиту не состоялась в результате обмена Гродненского монастыря на киевский Выдубицкий монастырь. Дипломом короля Владислава на сейме Речи Посполитой 1635 г. Гродненский монастырь был окончательно подчинён униатской иерархии (униаты уступили православным Выдубицкий монастырь). Во время войны России с Польшей в 1654–1667 гг. Гродненский монастырь был разорён. В последней четверти XVII в. продолжалось расхищение монастырского имущества, «в то время церковь стояла пустою, без дверей и окон, летом служила логовищем для скота». Повелением короля Августа II от 17 сентября 1697 г. Гродненский монастырь был передан «виленским базилианам». К началу XVIII в. монастырь пришёл в упадок, настоятели не могли противостоять произволу католической шляхты. Храм «не имел покрытия, но только четыре стены». В 1792 г., при архимандрите Симеоне (Огурцевиче), было обновлено здание церкви, построены дома для архимандрита и братии. К концу XVIII в. монастырь владел хуторами Понемонь, Чешевляны, лесом и лугами в Сокульском повете. В 1795 г., после третьего раздела Речи Посполитой, Гродно вошёл в состав Российской империи, в 1799 г. стал частью Минской и Литовской епархии, с 1840 г. – Литовской и Виленской епархии. Во время визитации базилианских монастырей 1828 г. обитель была отмечена среди немногих, где «исполнялись греческие обряды». С 1832 г. по поручению епископа Иосифа (Семашко) священником Виктором Бучинским проводилась редактура и устранение из литургии униатских элементов. В 1838 г. в качестве администратора в монастырь прибыл священник Лонгин Шавурский, занявшийся подготовкой к воссоединению монастыря с православием. В 1839 г., после воссоединения униатов, Гродненский монастырь был возвращён в православие, в 1842 г. возведён во второй класс. В шести деревянных кельях проживало 15 монахов, с 20 декабря 1839 г. настоятелем был архимандрит Игнатий (Железовский). Сам монастырь был «деревянный, уже ветхий».