После смерти Богутиновича (1513 г.) монастырём управляли его потомки, а в 1520 гг. – род Гринкевичей, который привёл обитель к потере имущества и разорению. В 1531 г. по жалобе архимандрита Ионы польский король Сигизмунд II Август лишил Богдана Гринкевича права опеки над монастырём, поручив обитель покровительству земского подскарбия И. Горностаевича. Согласно документам 1539 г., при монастыре обучали живописи, возможно, существовала иконописная школа. В 1546 г. архимандрит Иона жаловался королю на притеснения и грабежи со стороны светских лиц. Грамотой от 13 июля 1546 г. король Сигизмунд II велел дворянам Воловичу и Кунцевичу не чинить «кривд и втисков» братии, т.к. «это монастырь... наш господарский». Положение Гродненского монастыря улучшилось при архимандрите Мисаиле (с 1550 г.), который усердно заботился о монастырском имуществе. 28 декабря 1552 г. польская королева Бона Сфорца, согласно прошению архимандрита Мисаила, дала Гродненскому монастырю привилей на королевские «певные пущи» – Молявскую и Перстунскую. После смерти архимандрита Мисаила монастырём хитростью завладел ктитор Семён Волович, убедив короля, что «монахи при избрании себе настоятеля пришли в раздор и разошлись в разные стороны». Братии в Гродненском монастыре не осталось, для совершения богослужений Семён Волович нанял за небольшую плату белого священника. 12 августа 1568 г. монастырь перешёл в пожизненное владение гродненского подкомория Павла Котовича. Под властью светских лиц Гродненский монастырь находился до 1591 г., когда гродненский подскарбий Богдан Годкинский принял монашество с именем Климент и по благословению митрополита Михаила (Рогозы) возобновил архимандрию. Текст благословенной грамоты митрополита Михаила свидетельствует, что монастырь к тому времени был разорён, стены «обвалились и ошарпаны так, что не только самому архимандриту, но и учителям, причётникам и слугам церковным при церкви Божей жить негде». Архимандрит Климент (Годкинский) возобновил церковь Бориса и Глеба и другие постройки, отстаивал имущество монастыря в судах. В 1592 г. король Сигизмунд III Ваза подтвердил право Гродненского монастыря на владение землями, сенокосами и бортями на реке Соколдее, однако в 1613 г. архимандрит Климент был вынужден отстаивать это право в суде. В 1593 г. по его требованию гродненский староста Фёдор Иванович Скумин-Тышкевич, рассмотрев имущественные акты, провёл размежевание между землями монастыря и деревней Городницей, прекратив судебные разбирательства. Право на эти владения было подтверждено королевским привилеем от 20 мая 1596 г. Владения монастыря продолжали оспариваться, по просьбе архимандрита Климента король Сигизмунд III привилеем от 26 июня 1613 г. подтвердил право владения монастыря 36 уволоками леса и сенокосов, данное обители королями Александром и Сигизмундом I. Возвращён был и монастырский кирпичный завод, самовольно захваченный бернардинцами.