Алтарь, первоначально двухсторонний, состоит из двух частей – «Распятия», где лики Богоматери и Иоанна Богослова имеют подчёркнуто грубоватые черты, и «Несения Креста», в котором Грюневальд ограничивается общими указаниями на историческое место действия (башня на дальнем плане – образ Иерусалима, пейзаж в проёме правой арки – образ Голгофы). Смысловым центром композиции служат слова Священного Писания, начертанные на балке ренессансного здания (в чём исследователи усматривают намёк на папский Рим): «Esaias 53 er ist vmb vnser svnd willen geschlagen» («Исаия 53 Он изъязвлён был за грехи наши»). Сосредоточение внимания на теме Страстей, обращение к чувству личной греховности каждого христианина, введение в алтарное изображение «читаемого Слова Божия» часто рассматриваются исследователями (В.К. Цюльх, Пиндер, Ульманн, Арндт, Мёллер) как свидетельства влияния на Грюневальда сочинений М. Лютера. Более 30 сохранившихся рисунков Грюневальда представляют собой штудии к живописным произведениям (два рисунка с изображением головы кричащего, Государственные музеи Берлина; портрет Гвидо Гверси, 1512–1515 гг., Дворцовый музей, Веймар; «Распятие», 1520–1525 гг., Государственное художественное собрание, Карлсруэ, и др.), в том числе к несохранившимся (неоконченная штудия к майнцскому алтарю, Государственные музеи Берлина; три рисунка из так называемой Библии Ганса Плока, около 1503 и около 1511 гг., Гравюрный кабинет, Берлин, и др.), и выявляют тяготение Грюневальда к остроиндивидуализированной, часто гротескной трактовке человеческого образа. Грюневальду принадлежит одно из самых выразительных в истории западноевропейской живописи изображений страдающего Христа («Trias Romana», после 1520 г. (?), Гравюрный кабинет, Берлин). После смерти Грюневальда его произведения (часто приписываемые Альбрехту Дюреру и даже Питеру Паулю Рубенсу) продолжали высоко цениться любителями искусства; в особенности это касается изенхаймского алтаря: натурфилософский и космологический подтекст этого произведения привлекал внимание собирателей с алхимическими интересами, в частности, императора Рудольфа II. Как отдельная фигура в истории западноевропейского искусства Грюневальд был открыт во второй половине XIX в. (Якоб Кристофер Буркхард, Арнольд Бёклин, Шарль Мари Жорж Гюисманс). В начале ХХ в. Грюневальд, провозглашённый «иррационалистом» и антиподом «слишком академичного» А. Дюрера (Генрих Вёльфлин, Шмид), стал культовой фигурой европейского модернизма (Райнер Мария Рильке, Пабло Пикассо, Анри Матисс) и немецкого экспрессионизма (Макс Бёкман, Эмиль Нольде). Примером истолкования образа Грюневальда как поборника традиционных ценностей служит симфоническая поэма «Матис-художник» (1934 г.) и одноимённая опера (1938 г.) Пауля Хиндемита.