Начало «кальвинистского этапа» в истории университета связано с разработкой преподававшими там профессорами-кальвинистами доктрин, сформулированных в Гейдельбергском катехизисе 1563 г. (составители Захария Урсин и Каспар Олевиан). При курфюрсте-лютеранине Людвиге VI (1576–1583 гг.) из Пфальца было изгнано 500 кальвинистских семей, а из университета удалены все профессора-кальвинисты. Но в правление его преемника курфюрста Иоганна Казимира (1583–1592 гг.) кальвинисты были возвращены в университет, а лютеране изгнаны. Университет пережил относительный упадок в годы Тридцатилетней войны. В сентябре 1622 г. город и замок Гейдельберга были взяты Иоганном Церкласом Тилли, а университет практически прекратил работу. В 1629 г. началась его реорганизация в духе католицизма. Большинство кафедр было занято иезуитами. Однако в 1631–1652 гг. университет фактически прекратил существование. После Вестфальского мира (1648 г.) курфюрст Карл I Людвиг (1649–1680 гг.) восстановил университет. 1 ноября 1652 г. состоялось открытие университета, среди приглашённых в университет для преподавательской деятельности был представитель немецкого Просвещения Самуэль фон Пуфендорф, Бенедикт (Барух) Спиноза не принял приглашения, посчитав, что религиозные конфликты будут мешать занятиям философией. После пожара 1693 г. университет временно переехал во Франкфурт и в Вайнхайм (1694–1699 гг.), но в 1700 г. вновь был возвращён в Гейдельберг. При курфюрсте Иоганне Вильгельме (1690–1716 гг.) началось строительство новых университетских зданий, завершённое в 1735 г. Будучи католиком, курфюрст вновь пригласил в университет иезуитов (1703 г.). Наряду с протестантским был открыт католический богословский факультет. Первый ректор-иезуит был избран в 1709 г. В результате деятельности иезуитов был основан подготовительный семинарий, посещение которого приравнивалось к обучению в университете. После запрещения Ордена иезуитов большинство школ, находившихся в их ведении, было передано французскому Ордену лазаристов (1773 г.). В 1752 г. в университете впервые появилась кафедра математики и экспериментальной физики. В Гейдельберг из Кайзерслаутерна была переведена школа политической экономии, преобразованная в факультет политической экономии. В 1784 г. частью университета стала Коллегия национальной экономики. В результате наполеоновских войн и после заключения мира в Люневиле (1801 г.) университет потерял все владения на землях курфюршества на левом берегу Рейна. В этих условиях новый курфюрст (после 1806 г. – великий герцог) Карл Фридрих Баденский, которому отошла оставшаяся часть курфюршества на правом берегу Рейна, присоединённая к Бадену, издал эдикт (13 мая 1803 г.), согласно которому был основан государственный университет, статус которого получил древний университет в Гейдельберге. Согласно эдикту, университет состоял из пяти факультетов; пост ректора становился наследственным и принадлежал представителям правящего дома. Первым ректором преобразованного университета стал великий герцог Карл Фридрих. В 1805 г. университет получил современное название в честь двух основателей – Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg. В 1807 г. во Фрайбург был переведён католический богословский факультет и основан первый в структуре университета институт, который сформировали участники филолого-педагогического семинара.