Вместе с тем, согласно Созомену, лицом, приветствовавшим императора Константина, был Евсевий Кесарийский (около 263 – 340 гг.), что подтверждается и автором заглавий к «Жизни Константина». Помимо Феодорита Кирского о председательстве Евстафия на Соборе упоминают Антиохийский архиепископ Иоанн I (до 429 – 441/442 гг.), Гермианский епископ Факунд. Те же сведения содержатся в письме к императору Зинону (474–491 гг.), приписываемому папе Римскому Феликсу III (483–492 гг.). Из-за отсутствия соборных документов вопрос о председательстве Евстафия на Никейском соборе исследователями однозначно не решён. Они считают, что в числе возможных председателей могли быть Александрийский епископ Александр I (около 313 – 328 гг.), Иерусалимский епископ Макарий I (312/314 – 333/334 гг.) и Осий Кордубский. В толковании на Притч. 8:22 Евстафий приводит краткий рассказ о Соборе (воспроизведённый Феодоритом Кирским), имеющий особое значение как свидетельство непосредственного участника (из-за отсутствия актов Собора). Число присутствовавших на Соборе Евстафий определяет не в 318, а приблизительно в 270 человек, сообщает, что Евсевий Никомидийский прочитал своё исповедание веры, вызвавшее возмущение отцов Собора. После того как текст исповедания был публично разорван на заседании, сторонники Евсевия подписали Никейский Символ. По прошествии некоторого времени после Никейского собора начали появляться признаки антиникейской реакции, первой жертвой которой стал Евстафий. В предисловии к толкованию на Притч. 8:22 он выступил с резкой критикой отвергающих единосущие. Вскоре литературная полемика перешла в реальный конфликт: по сообщению святителя Афанасия Великого, Евстафий не принял в клир Леонтия (впоследствии Антиохийский епископ; 344–357 гг.), Феодосия Триполийского, Евдоксия (впоследствии Константинопольский епископ; 360–370 гг.), Евстафия Севастийского, Георгия Лаодикийского и Стефана (впоследствии Антиохийский епископ Стефан I; 342–344 гг.) и обвинил тех епископов, которые, не отказываясь полностью от никейского вероопределения, искажали его смысл, толкуя его в соответствии со своими взглядами. Через некоторое время Евстафий обвинил Евсевия Кесарийского в искажении никейской веры (последний, в свою очередь, обвинил Евстафия в савеллианстве). На Антиохийском соборе (между 327 и 330 гг.) состоялось осуждение Евстафия. Ариане, подкупив одну женщину, обвинили его в любодеянии, а когда была доказана ложь этого доноса, Евсевий Никомедийский донёс императору Константину, будто Евстафий оскорбительно отзывался о его матери. Исследователи не исключают, что это была правда. Елена раньше была язычницей, и конкубинат (сожительство) тогда был законным явлением. К тому же она была низкого происхождения – дочь содержателя трактира. Поэтому Евстафий и мог говорить о неславном прошлом Елены. Под предлогом посещения базилик, строившихся в Палестине императором Константином, Евсевий Никомидийский и Феоний Никейский с согласия императора отправились в Святую землю. Там они встретились со своими единомышленниками и из Палестины прибыли в Антиохию. Таким образом, в Антиохии впервые собрались ведущие представители антиникейской реакции: Евсевий Никомидийский, Феогний Никейский, Патрофил Скифопольский и Павел Тирский. Главным обвинителем Евстафия на Соборе выступил его преемник на Веррийской кафедре епископ Кир. По мнению большинства древнецерковных писателей, истинной причиной суда над Евстафием была его мужественная защита никейской веры, однако мотивация соборного обвинения излагалась по-разному. Иероним, Феодорит и Созомен утверждают, что Евстафия обвинили в безнравственном поступке.