К середине XVII в. в Далматовском монастыре проживали шесть монахов, около 20 крестьян с семьями и трудники. По благословению митрополита Сибирского Корнилия в октябре 1666 г. в Далматовском монастыре было учреждено игуменство, первым настоятелем был избран сын Далмата Исаак (Мокринский; с 1702 г. – архимандрит). В том же году в Далматовском монастыре был пострижен в монашество Афанасий (Любимов), с 1675 г. – игумен Далматовского монастыря, с 1682 г. – первый архиепископ Холмогорский и Важский. Настоятели Далматовского монастыря осуществляли надзор за церквами ближайших слобод, рассматривали жалобы на священников близлежащей округи, выполняли поручения по расследованию конфликтов в соседних монастырях; в 1670 гг. старцы Далматовского монастыря служили управляющими на Новопышминской заимке Тобольского архиерейского дома. Как полагают исследователи, братия Далматовского монастыря не сразу приняла церковную реформу патриарха Никона и некоторое время поддерживала связи со старообрядчеством. Ряд местных приверженцев «древлего благочестия», перед тем как устроить самосожжение, передавали в Далматовский монастырь своё имущество. Возможно, к мнению Далмата апеллировали деятели зауральского старообрядчества в полемике об антихристе. Анатолий Тимофеевич Шашков приписывает Далмату адресованное старообрядцам «Послание об антихристе и тайном царстве его». Игумены Исаак и Афанасий подвергались опалам «за церковные вины». Только в 1685 г. с игумена Исаака окончательно были сняты все запрещения с условием, чтобы «с раскольниками раскола не говорил, а помнил совесть свою». Вместе с тем его дважды (в 1679 и 1682 гг.) посылали увещевать крестьян-старообрядцев, собиравшихся устроить массовое самосожжение. В 1694/1695 г. игумен Исаак (Мокринский) сопровождал Сибирского и Тобольского митрополита Игнатия (Римского-Корсакова) в поездке по епархии, во время которой были открыты мощи Симеона Верхотурского. В 1691 г. в Далматовском монастыре проживали 27 человек, в 1722 г. – 41 человек, в основном, выходцы из крестьян и служилого сословия. После ограничений на постриг (введён по России указом от 28 января 1723 г.) к 1755 г. численность братии сократилась до 13 человек, среди насельников, в основном, были вдовые иереи и отставные военные. В 1764 г. Далматовский монастырь был определён в число штатных обителей третьего класса. До 1830 гг. в монастыре проживали от 7 до 13 человек, с 1830 гг. до конца XIX в. – от 16 до 33 человек, что превышало штатное количество мест. Первая опись вотчины Далматовского монастыря была составлена в 1651 г. тобольским сыном боярским Павлом Яковлевичем Шульгиным, когда братия обратилась с челобитной к царю Алексею Михайловичу и тобольскому воеводе Василию Борисовичу Шереметеву с просьбой о пожаловании им земель «около своей пустыни о пустой земле и об рыбных ловлях и о всяких угодьях». Царской грамотой от 17 мая 1659 г. владения «от Белого Городища вверх по Исети» с крестьянами были окончательно закреплены за Далматовским монастырём: межевая черта монастырских земель простиралась на 67 «верст тысячесаженных».