С этого времени сведения об участии Димитрия Иоанновича в управлении государством исчезают, в Новгородской земле жалованные грамоты выдавались от имени двух великих князей – Иоанна и Василия. Хотя в источниках Димитрий Иоаннович продолжал упоминаться как «великий князь», Василий стал выдавать жалованные грамоты и на другие русские земли и выступать в роли верховного судьи – фактически соправителя отца. 11 апреля 1502 г. Иоанн III наложил опалу на Димитрия Иоанновича и его мать и приказал заключить их в тюрьму, «и от того дни не велел их поминати в октениах и литиах, ни нарицати великим князем», а 14 апреля «пожаловал сына своего Василиа благословил и посадил на великое княжение Володимерское, и Московское, и всеа Русии самодръжцем». Причины опалы Димитрия Иоанновича исследователя неизвестны. Она могла быть обусловлена активными действиями Василия в 1500 г., который, «хотя великого княжения», предпринял демонстративный отъезд к Вязьме, в район боевых действий с Литовским великим княжеством. Позднее Иоанн III говорил о какой-то «грубости» внука по отношению к нему. Возможно, сыграло роль и убеждение в близости матери Димитрия Иоанновича Елены Волошанки к еретикам-«жидовствующим», впоследствии осуждённым на Соборе 1504 г. По сообщению австрийского дипломата Сигизмунда фон Герберштейна, в 1505 г., перед смертью, Иоанн III приказал освободить внука и просил у него прощения, но новый великий князь приказал бросить Димитрия Иоанновича в тюрьму, где, по одним сведениям, тот «погиб от голода и холода», а по другим – «задохнулся от дыма». По мнению князя Андрея Михайловича Курбского, Димитрий Иоаннович был удавлен. Он был похоронен в московском Архангельском соборе рядом с могилой отца. В сообщении о смерти Димитрия Иоанновича в летописном своде 1518 г. он назван «благоверныи князь велики». Существует предположение, что прижизненное изображение юного Димитрия Иоанновича (в составе великокняжеской семьи, со скрещенными на груди руками, в венце и с нимбом) находится на шитой пелене конца XV – начала XVI в. (1498 г.?) великой княгини Елены Волошанки (Исторический музей). В Лицевом летописном своде 1570 гг. содержится цикл миниатюр с подробным повествованием о чине венчания Димитрия Иоанновича на царство: приготовление места, слово великого князя, благословение и молитва первосвятителя, возложение барм и шапки Мономаха, молитвы и поздравления, поучение митрополита, литургия, осыпание Димитрия Иоанновича монетами после выхода из собора и т.п. Димитрий Иоаннович представлен безбородым юношей в княжеских одеждах, с «шапкой» кудрявых русых волос. Кроме того, в рукописи имеются другие композиции с его участием, например, рождение Димитрия Иоанновича, рассказ о его опале, преставление «в тюрьме» и отпевание в Архангельском соборе, лежащего Димитрия Иоанновича во гробе в белых пеленах. В росписи Архангельского собора Московского Кремля 1652–1666 гг., выполненной по первоначальной программе 1564–1565 гг., Димитрий Иоаннович представлен в числе надгробных княжеских портретов на южной стене, рядом с отцом великим князем Иоанном Иоанновичем Молодым.