Результаты пребывания епископов в Риме обеспечили сторонникам унии полную поддержку польского короля Сигизмунда III, который предписал местным органам власти подавлять выступления противников унии. Выступления православных против организаторов унии продолжались. На Варшавском сейме (март-май 1596 г.) князь К.К. Острожский, выступая от имени православных дворян ряда воеводств Речи Посполитой, потребовал, чтобы у епископов, отступивших от православия, были отобраны кафедры и переданы православным в соответствии с традиционными нормами права. Когда король отказался это сделать, православные дворяне – противники унии заявили, что не признают организаторов унии своими епископами и не позволят им осуществлять свою власть на территории их владений. Против унии продолжали выступать братства и многие представители духовенства. Однако свободе общественного и религиозного самоопределения приходил конец. Уния стала государственной программой, а борьба с ней рассматривалась как политический бунт. Первым было наказано Виленское братство – универсалом короля от 22 мая 1596 г. митрополиту было приказано судить виленских братчиков как бунтовщиков и изгнать из Троицкого монастыря. 14 июня 1596 г. был опубликован королевский универсал: «Имея в виду древнее соединение церквей восточной и западной, всегда способствовавшие возвышению и процветанию государства и подражая примеру великих государей… среди других наших государственных забот мы обратили наше внимание на то, чтобы людей греческой религии в нашем государстве привести к прежнему единству с католической церковью римской, под властью одного верховного пастыря. С этой целью… отправлены были в Рим послами к папе владыки Владимирский и Луцкий. Побывав у св. отца, они уже вернулись назад и не принесли оттуда с собой ничего нового и противного вашему спасению, ничего отличного от ваших обычных церковных церемоний. Напротив, согласно с древним учением свв. отцов греческих и св. соборов, сохранили вам всё в целости, о чём и имеют дать вам подробный отчёт. И так как немало знатных людей греческой веры, желающих св. унии, просили нас, чтобы мы для окончания этого дела велели собрать Собор, то мы и позволили вашему митрополиту Михаилу Рогозе созвать Собор в Бресте, когда он с другими вашими старшими духовными признает то наиболее удобным. Мы уверены, что вы сами, когда хорошо подумаете, не найдёте для себя ничего полезнее, важнее и утешительнее, как святое соединение с католической церковью, которая водворяет и умножает между народами согласие и взаимную любовь, охраняет целость государственного союза и прочие блага земные и небесные». На Собор приглашались «католики римского костёла и греческой церкви, которые к этому единству принадлежат». Участие православных ограничивалось следующим положением: «Будет вольно и всякому православному явиться на Собор, только со скромностью и не приводить с собой толпы». Возможность участия в работе Собора представителей протестантства, с которыми у князя Острожского к этому времени были налажены контакты на почве совместного противостояния католицизму, было таким образом исключено. 21 августа 1596 г. Митрополит Киевский, Галицкий и всея Руси Михаил (Рогоза) назначил начало Собора на 6 октября. Король направил в Брест своих представителей во главе с Троцким воеводой Н.К. Радзивиллом, которого сопровождал военный отряд. На Соборе, помимо папских легатов и уполномоченных от короля, присутствовали Митрополит Рогоза и с ним пять епископов – Луцкий, Владимиро-Волынский, Полоцкий, Пинский и Холмский. Двое из семи епископов – Гедеон (Балабан) и Михаил (Копыстенский) – остались на стороне православных. Но почти под всеми документами, предрешившими унию, их подписи, данные авансом, уже имелись. Таким образом, формально под программой Собора стояли подписи всего западнорусского епископата. Патриархи Восточной церкви направили на Собор своих послов: Александрийского патриарха представлял протосинкел Кирилл Лукарис, который преподавал в Острожской школе с 1594 г., а Вселенского патриарха – протосинкелл Никифор, с 1592 г. являвшийся патриаршим экзархом в Молдавии и Польше. После приезда в Польшу Никифор был арестован в пограничном Хотине, но, по ходатайству православных, был освобождён.