Позже царь снял опалу, и в 1580 г. из Москвы прибыл новый настоятель игумен Кирилл (Завидов; 1580–1584 гг.). Собрав братию и возобновив строгий общежительный устав, он начал подготовку к обретению мощей преподобного Антония, которое состоялось в 1597 г. (в том же году произошла и общерусская канонизация святого). Его мощи были положены в окованную серебром раку в Рождественском соборе, в 1731 г. переложены в новую, также окованную серебром, кипарисовую раку. При раке находилась ветвь осоки, с которой, по преданию, преподобный Антоний приплыл из Рима. В особом приделе у западной стены собора хранился камень, на котором, согласно «Житию», преподобный приплыл из Рима в Новгород. Инок обители Нифонт в сочинении «О преложении честного и многочудесного тела» (март 1598 г.) описал чудеса, совершившиеся в монастыре при обретении мощей преподобного. Наставником Нифонта был инок монастыря Антония Римлянина – иконописец Анания, написавший для обители немало икон. В память преподобного в первую пятницу после праздника святых апостолов Петра и Павла (29 июня) был учреждён крестный ход из новгородского собора Святой Софии в монастырь Антония Римлянина. В начале XVII в. монастырь был разорён шведскими отрядами, затем восстановлен. В 1651 г. в нём была учреждена архимандрития. В 1656 г. монастырь посетил Антиохийский патриарх Макарий, о чём сохранилось свидетельство патриаршего архидиакона Павла Алеппского. Не раз посещали обитель и члены царствующего дома. Особое покровительство монастырю оказывали Новгородские митрополиты Макарий (1652–1663 гг.) и Питирим (1664–1672 гг.), следствием чего стала активная строительная деятельность в обители. В 1670 гг. в трапезной палате деревянные перекрытия были заменены каменными сводами, надстроена столпообразная колокольня, а над южными вратами возведена церковь в честь Усекновения главы Иоанна Предтечи (разобрана в 1805 г.). В 1698 г. к северу от надвратной церкви Иоанна Лествичника попечением воеводы Петра Матвеевича Апраксина (1659–1728 гг.) выстроили каменную больницу с церковью во имя Александра Невского (разобрана в начале XIX в.). В 1699–1701 гг. к западу от собора были возведены казначейские кельи, в 1715–1722 гг. – южная линия корпусов (кельи, квасоварня, баня и др.) с оградой, в 1718 г. между трапезной палатой со Сретенской церковью и казначейскими кельями построена келарская палата. В 1708–1723 гг. монастырь Антония Римлянина стал кафедральным, в нём размещалась резиденция Новгородских викарных епископов. В XVIII–XIX вв. 25 настоятелей монастыря стали архиереями. В 1775 г., после того как сгорел новгородский Сокольницкий монастырь, в монастырь Антония Римлянина были перенесены мощи преподобных братьев Алфановых, помещены в приделе во имя апостола Иоанна Богослова Рождественского собора, где почивают и в настоящее время.